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1、免疫組化操作步驟 一 免疫組化（ LP 法）操作步驟 ： 1． 切片常規(guī)脫蠟至水。

2、如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行 2. 緩沖液洗 3min/2 次。

(相關(guān)資料圖)

3、 3. 為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。

4、 4. 緩沖液洗 5min/2 次。

5、 5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。

6、 （注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會(huì)導(dǎo)致特異性染色降低。

7、如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。

8、） 6. 緩沖液洗 5min/2 次。

9、 7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時(shí)。

10、（具體孵育時(shí)間和溫度由試驗(yàn)者最終決定） 8. 緩沖液洗 5min/2 次。

11、 9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增強(qiáng)子 ) , 在室溫下孵育 20 分鐘。

12、 10 ．緩沖液洗 5min/2 次。

13、 11 ．滴加 HRP Polymer( 酶標(biāo)二抗 ) ，在室溫下孵育 30 分鐘。

14、 （注： HRP Polymer 對光敏感，應(yīng)避免不必要的光暴露并儲(chǔ)存在不透明的小瓶中。

15、） 12 ．緩沖液洗 5min/2 次。

16、 13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。

17、（具體時(shí)間由染色深淺決定。

18、） 14 ．自來水充分沖洗 , 復(fù)染，脫水 , 透明 , 封片。

19、 二．免疫組化 ( 三步法 ) 操作步驟 ： （ 1 ）、石蠟切片脫蠟至水。

20、 （ 2 ）、 3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。

21、 （ 3 ）、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）。

22、 （ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。

23、滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時(shí)或 4 ℃ 過夜。

24、 （ 5 ）、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

25、 （ 6 ）、滴加適量 生物素標(biāo)記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。

26、 （ 7 ）、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

27、 （ 8 ）、滴加適量的 辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。

28、 （ 9 ）、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

29、 （ 10 ）、顯色劑顯色 3-15 分鐘（ DAB 或 NBT/BCIP ） （ 11 ）、自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

30、 三. 冰凍切片免疫組化染色步驟： 冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。

31、以下同石蠟切片免疫組化。

本文到此講解完畢了，希望對大家有幫助。

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